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產(chǎn)品目錄號(hào)： M1701 M1705
M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶簡明操作步驟
cDNA*鏈合成操作步驟：
請使用者準(zhǔn)備：
z 重組 RNasin?核酸酶抑制劑 (目錄號(hào) N2511)
z dATP,10mM
z dCTP,10mM
z dGTP, 10mM
z dTTP, 10mM
z 無核酸酶的水
1． 在一支無核酸酶污染的小離心管中加入： RNA 2ug 引物 1ug 無核酸酶水補(bǔ)齊 15ul 加熱離心管到 70℃，5 分鐘，這樣可以打開模板的二級(jí)結(jié)構(gòu)。然后立即在冰上冷卻，以避免重新形成二級(jí)結(jié)構(gòu)。短暫離心，使溶液歸于管底。
2. 按以下順序在復(fù)性的引物/模板管(即以上小離心管)
中加入下列組分：
注意：不要改變引物與 mRNA的比例。
M-MLV 5XReaction Buffer 5ul
dATP,10mM 1.25ul
dCTP,10mM 1.25ul
dGTP, 10mM 1.25ul
dTTP, 10mM 1.25ul
重組 RNasin?核酸酶抑制劑 25units M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶 200units 加無核酸酶水補(bǔ)齊 25ul
3. 輕彈離心管混合溶液。若使用隨機(jī)引物，在 37℃孵育 60分鐘進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)；若使用其它引物(Oligo (dT)或基因特異引物)，則在 42℃孵育 60分鐘進(jìn)行反應(yīng)。
4. 第二條鏈合成可使用您選擇的操作方法，也可參考:
Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. (1989) In: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 8.64.
注意：M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶緩存液與許多下游應(yīng)用相容。在進(jìn)行第二鏈合成或 PCR 之前，一般無需使用酚抽提及乙醇沉淀純化合成的*鏈 cDNA。
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